Neivazivno odkrivanje Downovega sindroma – NIPT

V zadnjem desetletju smo priča zelo hitremu razvoju in novimdognanjem na področju uporabnosti proste fetalne DNK inRNK v materini plazmi v povezavi z odkrivanjem monogenskihbolezni, neivazivnim določevanjem spola pri plodu zaradi Xspolno vezanih dednih bolezni, določevanjem Rhesus-D inRHCE genotipa ploda in klinično uporabnostjo pri kongenitalniadrenalni hiperplaziji ter hemolitični bolezninovorojenčka, povzročeni z anti-D, anti-c/C ali anti-Ealoprotitelesi. Razvoj in raziskave na področju proste fetalneDNK so v zadnjih nekaj letih intenzivno usmerjene predvsem vrazvoj metod prenatalnega neinvazivnega presejanja za najboljpogoste avtosomne trisomije z visoko stopnjo odkrivanja in zelo nizkim odstotkom lažno pozitivnih primerov.

¹ Darija M. Strah, dr. med., Diagnostični center Strah, Slamnikarska 3a, 1230 Domžale

²Janez Bernik, univ. dipl. bioteh., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva cesta 7, 1000 Ljubljana

IZVLEČEK

Ključne besede: neinvazivno predporodno presejanje, prosta plodova DNK, Downov sindrom, anevploidije, masivno paralelno sekveniranje.

Odkritje in potrditev prisotnosti proste plodove DNK v krvnem obtoku nosečnice v letu 1997 predstavlja odločilen mejnik za raziskave na področju neinvazivnega predporodnega testiranja (NIPT). Delež proste plodove DNK v povprečju znaša 10-20 %, čeprav močno varira in je odvisen od različnih dejavnikov. V preteklem desetletju so se razvile različne metode za določanje kromosomskih anevploidij na osnovi proste plodove DNK. Kot najustreznejša, najbolj zanesljiva in tudi najpogosteje uporabljena se je uveljavila tako imenovana metoda masivnega paralelnega sekveniranja. V kliničnih študijah je bilo pokazano, da je metoda masivnega paralelnega sekveniranja in njene variacije primerna za visoko zanesljivo presejanje najpogostejših kromosomskih anevploidij v prvem trimesečju nosečnosti. Mnenja posameznih združenj so si podobna glede indikacij za NIPT, mnenja, kdo lahko svetuje pred testom in po njem, so si različna. Strokovnjaki so si edini, da NIPT trenutno predstavlja izjemno zanesljiv presejalni test, pri katerem mora biti vsak pozitiven izvid potrjen z eno od klasičnih oblik invazivne diagnostične preiskave.

ABSTRACT

Key words: non-invasive prenatal testing, cell-free fetal DNA, Down syndrome, aneuploidies, massively parallel sequencing.

The discovery of cell-free fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma in 1997 represents a key breakthrough to the further progress that has been made in the field of non-invasive prenatal testing (NIPT). On average 10-20 % of cffDNA is present in the maternal plasma; however this proportion varies strongly and it depends on different factors. Several methods for detecting chromosomal aneuploidies in early pregnancy has been developed in last decade, amongst which massively parallel sequencing (MPS) has been shown to be the most accurate, appropriate and the most commonly used one. Clinical studies have shown that the method of massive parallel sequencing together with its variations is suitable for highly reliable screening of the most common chromosomal aneuploidies in the first trimester of pregnancy. Several medical associations published their opinion and guidelines for the implementation of NIPT in clinical practice. Their statements are consistent in the aspect of the indications when NIPT should be advised to the pregnant women while there are some uncertainties regarding pre- and post- testing counseling to be answered. The experts agree that NIPT method represents highly accurate advanced screening test, therefore in case of positive results patients should undergo one of the conventional invasive diagnostic procedures.

UVOD

Presejalni testi za odkrivanje anevploidij v prvem trimesečju nosečnosti predstavljajo uveljavljeno klinično prakso predporodne oskrbe nosečnic že skoraj 20 let (1). Testi upoštevajo različne kriterije: starost nosečnice, ultrazvočno merjenje debeline nuhalne svetline (NS) ploda in drugih kromosomskih označevalcev v prvem trimesečju ter stanje hormonskih označevalcev v prvem in drugem trimesečju. Napovedano visoko tveganje za anevploidije potrdimo ali ovržemo bodisi z biopsijo horionskih resic v prvem ali amniocentezo v drugem trimesečju. S presejanjem nuhalne svetline in dvojnega hormonskega testa glede na mednarodne podatke odkrijemo približno 90 % plodov z Downovim sindromom (DS), ob lažno pozitivni stopnji (FPR) 5 % (2). Primerljive rezultate dosegamo tudi v Sloveniji, kjer z merjenjem debeline NS in oceno nosne kosti odkrijemo 85 % plodov z DS ob 2,8 % FPR (3). Vendar glede na prevalenco DS še vedno večina nosečnic opravi invazivno diagnostično preiskavo, pri kateri tvega neželeno prekinitev nosečnosti, izkaže pa se, da gre za lažno pozitivni izvid presejalnega testa (3). Zato strokovna javnost z zanimanjem spremlja razvoj nove metode neinvazivnega predporodnega testiranja (NIPT) za anevploidije na osnovi proste plodove DNK in morebitno vpeljavo v klinično prakso kot zelo zanesljiv presejalni test.

PROSTA PLODOVA DNK

Kljub začetni nejasnosti glede natančnega celičnega izvora proste plodove DNK v krvnem obtoku nosečnice (4) je nedavna raziskava pokazala, da slednja izhaja iz citotrofoblasta, notranje plasti trofoblasta (5). Iz venske krvi nosečnice jo je moč izolirati od 7. gestacijskega tedna dalje (6). Njen delež znaša v povprečju 10-20 %, čeprav močno varira od 3-40 % (7,8,9), kar je odvisno od različnih faktorjev, kot je gestacijski teden, telesna teža nosečnice in morebitne komplikacije tekom nosečnosti (7,10,11). Njen razpolovni čas znaša od 4-30 minut, zato je v nekaj urah po porodu v krvnem obtoku matere ne zaznamo več (12). Fragmenti proste celične DNK ploda so zelo majhni, povprečne dolžine 150 baznih parov (bp) in le redko presegajo 300 bp (13,14).

Možnosti neinvazivnega odkrivanja anevploidij pri plodu so bile prvič nakazane leta 1969, ko so potrdili prisotnost plodovih celic v krvnem obtoku nosečnic (15). Leta 1997 so z analizo kromosoma Y ugotovili, da se v krvnem obtoku nosečnic poleg plodovih celic nahaja tudi prosta plodova DNK (6), ki je v primerjavi s plodovimi celicami prisotna v veliko večji meri in je zato primernejša za analizo.

Po letu 1997 je prišlo do opaznega porasta raziskav na področju določanja krvne skupine, spola in Rhesus D statusa ploda s pomočjo proste plodove DNK (16,17,18,19,20). Možnost predporodnega odkrivanja anevploidij je zaživela z razvojem sekveniranja nove generacije.

PREGLED METOD PREDPORODNEGA DOLOČANJA KROMOSOMSKIH ANEVPLOIDIJ NA OSNOVI PROSTE PLODOVE DNK

Prosto DNK iz krvne plazme matere izoliramo s klasičnimi metodami izolacije DNK. Nadaljnja analiza z izoliranim dednim materialom je odvisna od posamezne metode določevanja prisotnosti kromosomskih anevploidij. Do danes so bile na področju neinvazivnih tehnik predporodnega odkrivanja anevploidij uporabljene različne metode, ki bodisi temeljijo na analizi DNK, vključno z imunoprecipitacijo metiliranih regij DNK (MeDiP) (21), profilom polimorfizmov posameznega nukleotida kromosoma 21 (22), bodisi na analizi RNK, vključno z analizo SNP-ja v genu PLAC4 z masno sprektrometrijo (23) oziroma analizo več SNP-jev znotraj gena PLAC4 prek reverzne transkripcije in od ligacije odvisnega hkratnega pomnoževanja sond (RT-MLPA) (24). Prav tako so bile uporabljene metode, ki temeljijo na analizi profila serumskih proteinskih označevalcev (25). Z razvojem sekveniranja nove generacije in posledičnim padcem cene sekveniranja se je kot najustreznejša, najbolj zanesljiva in tudi najpogosteje uporabljena uveljavila tako imenovana metoda masivnega paralelnega sekveniranja (angl. massively parallel sequencing, MPS).

Masivno paralelno sekveniranje

S to metodo lahko danes rutinsko določimo zaporedje milijonov ali celo milijard fragmentov DNK (26). Določanje zaporedja poteka istočasno ob klonsko namnoženih fragmentih DNK v mnogih prostorsko ločenih celicah. Rezultat takega postopka so številna zaporedja krajših fragmentov DNK, pri čemer se isti fragment DNK prebere večkrat. To poimenujemo s terminom »pokritost«. Zaznavanje stopnje pokritosti je osnovni princip določanja kromosomskih nepravilnosti (27). V primeru trisomije 21 gre pričakovati, da bo pokritost fragmentov, ki izhajajo iz kromosoma 21, v primerjavi s fragmenti iz ostalih kromosomov, statistično značilno večja. Povedano drugače, kadar fragment DNK iz kromosoma 21 preberemo statistično značilno večkrat kot običajno, lahko z izredno veliko zanesljivostjo določimo prisotnost trisomije 21 kromosoma. Enak princip velja tudi za ostale anevploidije.

Naključna ter tarčna metoda MPS

Pri metodi MPS ločimo dva osnovna pristopa. Najpogosteje uporabljen pristop je tako imenovana naključna (ang. shotgun) metoda MPS (MPSS), ki je podrobneje opisana v raziskavi Ehricha s sod. (27). Fragmente DNK sekveniramo po celotnem genomu, torej naključno, ne glede na to, kateremu kromosomu fragmenti DNK pripadajo. Sparks s sod. opiše razvoj tarčne (angl. target) metode MPS, ki so jo poimenovali DANSR (angl. digital analysis of selected regions) (28). Njena prednost je, da z njo analiziramo le fragmente DNK, ki pripadajo izbranim kromosomom. Posledično je moč doseči večjo pokritost posameznega fragmenta oziroma lahko istočasno analiziramo več vzorcev. Različica tarčne metode MPS je analiza le polimorfnih mest genoma (29), kar jim je omogočilo, da so pridobili ogromen nabor fragmentov DNK, ki so pripadali le plodu.

PREGLED RAZISKAV

Do danes so bile z uporabo metode sekveniranja DNK izvedene številne raziskave, v katerih so z metodo MPS analizirali uspešnost odkrivanja različnih oblik anevploidij, najpogosteje trisomij kromosoma 21 (T21) (9,27,30), T21 in T18 (31,32,33,34,35,36), T18 in T13 (37), T13 (38), analizo vseh treh trisomij (39), oziroma so se osredotočali tako na analizo najpogostejših treh trisomij, kot tudi na analizo anevploidij spolnih kromosomov (29,40,41,44). Večina raziskav je bila izvedenih na vzorcu nosečnic z visokim tveganjem (9,27,29-44). Nicolaides in sod. so kot prvi potrdili primernost metode tudi na vzorcu nosečnic z nizkim tveganjem (45).

Značilnosti najpomembnejših raziskav na področju neinvazivnega odkrivanja anevploidij so podrobneje predstavljene v Tabeli 1.

Tabela 1: Pregled najpomembnejših raziskav na področju predporodnega odkrivanja anevploidij na osnovi proste plodove DNK in tehnologije MPS

*FPR: lažno-pozitivni izvid (raziskava je bila izvedena na vzorcu nosečnic z nizkim tveganjem); T21: trisomija 21; T18: trisomija 18; T13: trisomija 13

SEDANJE OMEJITVE NIPT PRI DOLOČEVANJU ANEVPLOIDIJ

Tehnike NIPT v sedanjem razponu lahko z visoko občutljivostjo in majhno stopnjo lažno pozitivnih izvidov določijo T21, T18 in T13, vendar ne smemo pozabiti, da so skoraj vse študije opravljene na vzorcu nosečnic z visokim tveganjem in enoplodno nosečnostjo. Prav tako je malo podatkov glede odkrivanja mozaične oblike trisomije, čeprav je potencial in visoka specifičnost metode NIPT tudi tu že pokazana (41).

Z NIPT trenutno izvajamo visoko-zanesljivo presejanje le za T21, T18 in T13, zato z NIPT v primerjavi z amniocentezo ne odkrijemo približno 50 % citogenetskih nepravilnosti – po podatkih raziskav, pri nosečnicah, mlajših od 35 let, odkrijemo 75 % vseh citogenetskih nepravilnosti, medtem ko pri nosečnicah, starejših od 35 let, ta odstotek pade na 43 % (42,43).

Trenutne metode NIPT omogočajo uspešno analizo vzorcev, v kolikor je delež proste plodove DNK v krvnem obtoku matere višji od 4 %. V nedavno objavljeni študiji je bilo pokazano, da ima pomemben vpliv na delež proste plodove DNK teža nosečnice. V povprečju pri nosečnicah s težo 60 kg lahko pričakujemo manj kot 1 % primerov z deležem proste plodove DNK, manjšim od 4 %. Pri nosečnicah s težo 160 kg pa lahko pričakujemo, da bo delež proste plodove DNK prenizek v več kot 50 % primerov (11).

Do sedaj imamo premalo podatkov o testiranju NIPT pri dvo- ali večplodni nosečnosti, še posebno pri diskordantnosti. Canick s sod. poroča, da so uspešno odkrili 7 nosečnosti s T21 in eno nosečnost s T13, prav tako so pravilno določili vseh 17 evploidnih dvoplodnih nosečnosti (46). Teoretično lahko prisotnost DNK evploidnega zarodka razredči anevploidno DNK prizadetega zarodka v vzorcu in tako oteži oceno pravega stanja. Čeprav so začetni rezultati ohrabrujoči, je podatkov za priporočilo klinične uporabnosti še premalo.

PRIPOROČILA ZA IZVAJANJE NIPT

V zadnjem času se v vseh strokovnih člankih, v katerih so objavljeni izsledki kliničnih študij, sistematično uporablja izraz NIPT (angl. non-invasive prentatal testing). NIPT je izjemno zanesljiv presejalni test, v strokovni literaturi imenovan kot »advanced screening test« za odkrivanje trisomije 21., 18. in 13. kromosoma (47). Zato moramo vsak pozitiven izvid NIPT potrditi z eno od klasičnih oblik invazivne diagnostične metode (45).

Združenje ACOG (The American College of Obstetricians and Gynecologists, The Society for Maternal – Fetal Medicine Publications Commitee) je decembra 2012 sprejelo priporočila za presejanje z NIPT (48). V mnenju so navedene indikacije, ob katerih je priporočljivo testiranje NIPT:

–          starost matere 35 let in več ob porodu,

–          ultrazvočni izvid ploda, ki nakazuje možnost anevploidije,

–          anamneza predhodne nosečnosti z dokazano anevploidijo,

–          pozitivni presejalni test bodisi zgodnje morfologije z nuhalno svetlino in/ali dvojnega hormonskega testa, sekvenčnega, integriranega presejalnega testa ali četvernega hormonskega testa,

–          uravnotežena Robertsonova translokacija pri starših s povišanim tveganjem za trisomijo 21 ali 13.

V okviru predtestnega svetovanja je treba poudariti, da gre za izredno zanesljiv presejalni test in da je namenjen le odkrivanju najpogostejših treh kromosomskih trisomij. Pozitivnemu testu NIPT sledi priporočilo za genetski posvet in invazivna diagnostična preiskava. Negativni izvid ne izključi nosečnosti s kasnejšimi možnimi zapleti, test ni zamenjava za še vedno najbolj zanesljivi metodi kot sta amniocenteza in biopsija horionskih resic. NIPT testiranje trenutno še ni primerno za večplodne nosečnosti. Strokovnjaki so si enotni, da ostane sprejeto presejanje za DS v obsegu, kot ga izvajamo do sedaj (48). V primeru ultrazvočno vidnih sumljivih znakov za anevploidijo naj se ponudi klasična invazivna diagnostika.

Podobno mnenje je sprejelo tudi združenje ISPD (International Society of Prenatal Diagnosis). Testiranje NIPT je ob ustreznem genetskem svetovanju primeren presejalni test za nosečnice s povišanim tveganjem za trisomijo 21. Pozitiven rezultat testiranja NIPT je potrebno potrditi z invazivno diagnostično preiskavo (49).

Združenje NSGC (National Society of Genetic Counselors) prav tako ugotavlja, da je NIPT testiranje primerno za nosečnice s povišanim tveganjem za kromosomske nepravilnosti. Testiranje NIPT naj bo nosečnicam ponujeno v sklopu privolitve po pojasnilu in ustreznega genetskega svetovanja. V primeru pozitivnega testa mora biti pacientka napotena na potrditev z invazivno diagnostično metodo (50).

V Sloveniji priporočil za izvajanje NIPT kot uradno sprejetih smernic še nimamo.

Mnenja posameznih združenj so si podobna glede indikacij za NIPT, mnenja, kdo lahko svetuje pred testom in po njem, so si različna. ACOG priporoča predtestno svetovanje, ki ne sme potekati kot del rutinskega vodenja nosečnosti, temveč kot posvet s podpisano privolitvijo po pojasnilu, opravi ga ginekolog porodničar (48). V primeru pozitivnega NIPT se nosečnico napoti za genetsko svetovanje. NSGC priporoča posvet genetskega svetovalca (50) pred in po testu. EuroGentest Network of Excellence definira pojem strokovnjaka s primernimi znanji, ki sme opraviti genetski posvet. Običajno je to specialist genetski svetovalec (klinični genetik, genetski svetovalec ali medicinska sestra z znanji genetskega svetovanja). Svetovanje lahko opravlja tudi strokovnjak druge stroke z osvojenim znanjem svetovanja, kot je npr. specialist ginekologije in porodništva v primerih predtestnega svetovanja pri tveganju za anevploidije zaradi povečane starosti nosečnice (51). Nedavno so se do NIPT opredelili tudi v Ameriškem združenju za medicinsko genetiko in genomiko (ACMG – American College of Medical Genetics and Genomics). Njihovo stališče je, da naj predtestno in potestno svetovanje opravlja ginekolog porodničar (prenatal/obstetric care provider), usposobljen strokovnjak (prenatal designee) oziroma genetski svetovalec. Predtestno svetovanje naj bo sestavni del NIPT, medtem ko naj se potestno svetovanje opravi v primeru pozitivnega NIPT (52).

POMEN NIPT ZA SEDANJE KLINIČNO DELO

V vsem času od uvedbe presejanja za kromosomske nepravilnosti je bilo odkrivanje DS največjega pomena. Presejanje na sprejeti način se je izkazalo uspešno tudi za odkrivanje drugih klinično pomembnih anevploidij pri nosečnicah z visokim tveganjem; z invazivnimi preiskavami je bilo odkritih tudi veliko klinično pomembnih mikroduplikacij ali delecij in z njima povezanih genetskih sindromov (2). Pomemben pomislek, kadar razmišljamo o uvedbi NIPT kot o primarnem presejanju za DS, je, da ne bomo odkrili vrsto drugih klinično pomembnih nepravilnosti, kot je npr. Turnerjev sindrom ali triploidija. Veliko kromosomskih nepravilnosti se pri uveljavljenem presejanju ultrazvočne zgodnje morfologije z merjenjem nuhalne svetline in dvojnim hormonskih testom v 11. do 14. tednu nosečnosti kaže podobno, bodisi s povečano nuhalno svetlino ali podobnimi biokemičnimi lastnostmi (2). Zato se priporoča, da ostane ultrazvočno presejanje v 1. trimesečju z dvojnim hormonskim testom v obsegu, kot ga izvajamo sedaj. NIPT pravzaprav predstavlja komplementarno metodo dosedanjemu presejanju in nikakor ne zamenjave, saj ne smemo pozabiti, da je ultrazvočno presejanje tudi diagnostično za nekatere večje strukturne nepravilnosti ploda in nekatere od njih, kot je npr. holoprosencefalija, moramo dodatno ovrednotiti z invazivno preiskavo (38). Invazivna diagnostična preiskava se priporoči tudi, kadar je NIPT za trisomijo 21 in 18 negativen, ultrazvočno pa zasledimo povišano NS ploda in strukturne defekte, omfalokelo, holoprosencefalijo, razširjen sečni mehur ali diafragmalno hernijo (2,53,54,55,56,57,58).

Uveljavljeno presejanje za DS v 1. trimesečju poleg ocene zgodnje morfologije in stanja ploda napoveduje tudi možnost nastanka preeklampsije in oceno prezgodnjega poroda (59). Vsekakor je cena NIPT v primerjavi z ustaljenim presejanjem zelo omejujoč dejavnik, vendar se pričakuje, da se bodo stroški za preiskavo v nekaj letih znatno znižali (47). Drugi omejujoči dejavnik je čas, ki ga potrebujemo, da dobimo izvid. NIPT se izvede v 8-10 dneh. Zaradi tehničnih omejitev pri približno 1-5 % analiz izvida ni mogoče zagotoviti, in lahko se zgodi, da nosečnica ultrazvočnega presejanja v 1. trimesečju ne uspe več opraviti (60). Pogoja za vključitev NIPT v ustaljene presejalne predporodne programe sta zmanjšanje stroškov preiskave z izpopolnjevanjem tarčnih metod MPS in skrajšanje časa, potrebnega za pridobitev izvida (60).

ZAKLJUČEK

Rezultati do sedaj izvedenih raziskav s področja NIPT na osnovi proste plodove DNK so izjemno obetavni. Največ dokazov o primernosti metode imamo za določevanje trisomije 21, vedno več podatkov je na voljo tudi za trisomiji kromosomov 13 in 18, kjer zaradi majhne prevalence slednjih obstaja nekoliko več omejitev. Novejše raziskave vključujejo vedno večje skupine preiskovank, kjer opisane vrednosti glede občutljivosti in specifičnosti predstavljajo nov mejnik presejanja za tri najpogostejše anevploidije z visoko stopnjo odkrivanja.

Zaenkrat se ne smemo prenagliti, saj NIPT ne izkazuje diagnostičnih vrednosti. Ne moremo ga enačiti z diagnostičnim testom in kot tako ne predstavlja zamenjave za ustaljeni diagnostični preiskavi kot sta amniocenteza in biopsija horionskih resic. Predstavljalo naj bi novo komplementarno metodo presejanja ob ustaljenem načinu odkrivanja anevploidij v 1. trimesečju nosečnosti na osnovi ultrazvočne in hormonske preiskave. Gre za izjemno zanesljiv presejalni test, katerega pozitivne rezultate je potrebno potrditi z eno od invazivnih preiskav.

Literatura:

1. Nicolaides KH, Azar G, Byrne D, et al. Fetal nuchal translucency: ultrasound screening for chromosomal defects in the first trimester of pregnancy. BMJ. 1992; 304: 867-869.
2. Nicolaides KH. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn. 2011; 1: 7-15.
3. Strah DM, Pohar Perme M, Geršak K. Ultrazvočno presejanje za kromosomopatije v prvem trimesečju nosečnosti pri 13049 naključno izbranih nosečnicah. Med Razgl. 2011; 50: S 2: 87–92.
4. Bischoff FZ, Lewis DE, Simpson JL. Cell-free fetal DNA in maternal blood: kinetics, source and structure. Hum Reprod Update. 2005; 11 (1): 59-67.
5. Faas BH, de Ligt J, Janssen I, et al. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing-by-ligation and evidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells. Expert Opin Biol Ther. 2012; 12 Suppl 1: S19-26.
6. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997; 350: 485–487.
7. Lo YM, Tein MS, Lau TK, et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet. 1998; 62: 768-775.
8. Lun FM, Chiu RW, Allen Chan KC, et al. Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem. 2008; 54: 1664-1672.
9. Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011; 11, 342: c7401.

10.  Sekizawa A, Jimbo M, Saito H, et al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta, Clin Chem. 2002; 48 (2): 353-354.

11.  Ashoor G, Syngelaki A, Poon LC, Rezende JC, Nicolaides KH. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-3 weeks’ gestation: relation to maternal and fetalcharacteristics. Ultrasound Obstet Gynecol. 2013; 41 (1): 26-32.

12.  Lo YM, Zhang J, Leung TN, et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet. 1999; 64 (1): 218-224.

13.  Li Y, Zimmermann B, Rusterholz C, et al. Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms. Clin Chem. 2004; 50: 1002–1011.

14.  Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, et al. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing. Clin Chem. 2010; 56: 1279–1286.

15.  Walknowska J, Conte FA, Grumbach MM. Practical and theoretical implications of fetal/maternal lymphocyte transfer. Lancet. 1969; 1: 1119 –1122.

16.  Honda H, Miharu N, Ohashi Y, et al. Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of fetal DNA in maternal serum. Hum. Genet. 2002; 110: 75–79.

17.  Lo, YM, Hjelm NM, Fidler C, et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N Engl JMed. 1998; 339: 1734-1738.

18.  Finning, K. Martin P, Summers J, et. al. Effect of high throughput RHD typing of fetal DNA in maternal plasma on use of anti-RhD immunoglobulin in RhD negative pregnant women: prospective feasibility study. BMJ. 2008; 336: 816-818.

19.  Daniels G, Finning K, Martin P, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal blood group phenotypes: current practice and future prospects. Prenat Diagn. 2009; 29: 101–107.

20.  Van der Schoot CE, Soussan AA, Koelewijn J, et al. Non-invasive antenatal RHD typing. Transfus Clin Biol. 2006; 13: 53–57.

21.  Papageorgiou EA, Karagrigoriou A, Tsaliki E, et al. Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21. Nat Med. 2011; 17 (4): 510-513.

22.  Ghanta S, Mitchell ME, Ames M, et al. Non-invasive prenatal detection of trisomy 21 using tandem single nucleotide polymorphisms. PLoS One. 2010; 5 (10): e13184.

23.  Lo YM, Tsui NB, Chiu RW, et al. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat Med. 2007; 13 (2): 218-223.

24.  Deng YH, Yin AH, He Q, et al Non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21 by reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification. Clin Chem Lab Med. 2011; 49 (4): 641-646.

25.  Narasimhan K, Lin SL, Tong T, et al. Maternal serum protein profile and immune response protein subunits as markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21, 18, and 13. Prenat Diagn. 2013; 33 (3): 223-231.

26.  Schuster SC. Next-generation sequencing transforms today’s biology. Nat Methods. 2008; 5 (1): 16-18.

27.  Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, Tynan JA, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol. 2011; 204 (3): 205.e1-11.

28.  Sparks AB, Wang ET, Struble CA, et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn. 2012; 32 (1): 3-9.

29.  Zimmermann B, Hill M, Gemelos G, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn. 2012; 32 (13): 1233-41.

30.  Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 2011; 13 (11): 913-920.

31.  Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011 11; 342: c7401.

32.  Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, de Feo E, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clin Chem. 2011; 57 (7): 1042-1049.

33.  Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012; 207 (2): 137.e1-8.

34.  Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, Birdir C, et al. Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012; 206 (4): 322.e1-5.

35.  Dan S, Wang W, Ren J, Li Y, Hu H, et al. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors. Prenat Diagn. 2012; 32 (13): 1225-1232.

———————————————————————————————————————-

Tako meritev Nuhalne svetline, kot tudi NIFTY test, lahko opravite v našem diagnostičnem centru. Vpišite svoje podatke v obrazec na tej povezavi in sporočili vam bomo vse podrobnosti o opravljanju obeh pregledov.